支原體培養(yǎng)基使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

中文名稱：支原體培養(yǎng)基

英文名稱：Myoplasma Medium

漢語拼音：Zhiyuanti Peiyangji

【性    狀】  液體培養(yǎng)基為澄清，無雜質(zhì)，玫瑰紅色液體；固體培養(yǎng)基為淡黃色固體，加熱融化后無絮狀物或沉淀；固體培養(yǎng)基輔助液恢復(fù)至室溫后為橙色液體。

【作用與用途】  用于非禽源性支原體檢驗(yàn)。

【用法與判定】

1. 液體培養(yǎng)基  放在室溫半小時回溫，置于常溫水中輕輕搖動融化，待全部融化后分裝后使用。分裝量為：小瓶20ml/瓶，小管1.8ml/支。

2. 固體培養(yǎng)基  固體培養(yǎng)基和輔助液放在室溫半小時回溫。將固體培養(yǎng)基塑料蓋擰松一點(diǎn)，微波爐或水浴融化。微波爐融化時使用中火，每次1分鐘，待全部融化后使用。輔助液置于常溫水中輕輕搖動融化，待全部融化后使用。

當(dāng)固體培養(yǎng)基溫度降到50℃左右時，,輔助液37℃預(yù)熱后緩慢貼壁加入，混合均勻后按平皿規(guī)格加入適量培養(yǎng)基（例如直徑60mm的平皿加入固體培養(yǎng)基9ml）制成固體平板。

3. 檢驗(yàn)  取樣品5ml接種小瓶液體培養(yǎng)基，混勻后再從小瓶中取液體，分別移植到2支小管液體培養(yǎng)基（0.2ml/支）、2付固體平板（0.1~0.2ml/付），將小瓶與小管放37℃培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基放置37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后第5日、第10日、第15日從小瓶中取培養(yǎng)物移植2支小管液體培養(yǎng)基（0.2ml/支）和2付固體平板（0.1~0.2ml/付）。每日觀察培養(yǎng)物顏色有無變黃或變紫紅的現(xiàn)象，若無變化，在最后1次移植培養(yǎng)14日后停止觀察。在觀察期內(nèi)，如小瓶或任何1支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化（pH變化達(dá)±0.5）時，應(yīng)立即移植于2支小管液體培養(yǎng)基和2付固體平板進(jìn)行培養(yǎng)，觀察液體培養(yǎng)基是否出現(xiàn)恒定的pH變化以及固體培養(yǎng)基有無支原體菌落生長。

每次檢驗(yàn)時，均應(yīng)同時設(shè)立陰、陽性對照。陽性對照為接種1~10CFU/0.2ml質(zhì)控菌液（豬鼻支原體BTS-7株）的小管液體培養(yǎng)基，和接種1~50CFU/0.2ml質(zhì)控菌液的固體平板培養(yǎng)基；陰性對照為接種滅菌生理鹽水的小管液體培養(yǎng)基和固體平板培養(yǎng)基，同上法培養(yǎng)和觀察。

4. 結(jié)果判定

4.1 檢測結(jié)果有效性  當(dāng)陽性對照液體培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變黃，固體平板上出現(xiàn)支原體菌落；陰性對照液體培養(yǎng)基不變色，固體平板上無支原體菌落時，檢驗(yàn)有效，并作如下判定。

4.2 判定  若接種樣品的小瓶或小管培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變黃，且固體平板上可見支原體菌落，則判該樣品有支原體污染。

【注意事項(xiàng)】

1. 培養(yǎng)基自低溫環(huán)境取出，恢復(fù)到室溫后使用。液體培養(yǎng)基和輔助液常溫融化；固體培養(yǎng)基可微波爐或水浴加熱融化。

2. 制備固體平板時，固體培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，,輔助液37℃預(yù)熱后緩慢貼壁加入，輕搖混勻，避免出現(xiàn)氣泡。

3. 進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度檢驗(yàn)時的器皿，必須達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的要求。

4. 如液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或顏色變化，固體培養(yǎng)基平板表面干裂，應(yīng)停止使用。

【規(guī)    格】  支原體液體培養(yǎng)基80ml/瓶；支原體固體培養(yǎng)基60ml/瓶；支原體固體培養(yǎng)基輔助液13ml/瓶。

【貯藏與有效期】  支原體液體培養(yǎng)基-20℃以下保存，有效期為12個月；支原體固體培養(yǎng)基2~8℃保存，有效期為12個月；支原體固體培養(yǎng)基輔助液-20℃以下保存，有效期為12個月。

附：培養(yǎng)基檢驗(yàn)

1. 質(zhì)控菌株  檢驗(yàn)用質(zhì)控菌株為豬鼻支原體BTS-7株。將凍干種子恢復(fù)原量以10%的量接種支原體液體培養(yǎng)基，經(jīng)35~37℃培養(yǎng)至變色，作為第1代；將第1代培養(yǎng)基物按10%接種量接種支原體液體培養(yǎng)基，35~37℃培養(yǎng)12~72h，取活菌滴度≥10⁸CCU/ml培養(yǎng)物作為工作種子。在使用過程中凍干種子傳代次數(shù)不超過5代，工作種子在-20℃以下保存有效期為20日。

2. 檢驗(yàn)方法

2.1 靈敏度試驗(yàn)

（1）培養(yǎng)  取工作種子液用待檢液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋至10^-10，另設(shè)1支未接種液體培養(yǎng)基作為對照，置35~37℃培養(yǎng)5~7日；取10^-6稀釋度菌液0.2ml接種于固體培養(yǎng)基平板1個，另設(shè)1個未接種固體培養(yǎng)基平板作為對照，置37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7日。同時各做2組重復(fù)。

（2）結(jié)果判定  以培養(yǎng)基呈現(xiàn)生長變色的最高稀釋度作為其靈敏度。如果2組培養(yǎng)基靈敏度均≥10^-8，對照不變色；固體培養(yǎng)基均有支原體菌落生長，對照無支原體菌落生長，判培養(yǎng)基合格。若僅1組液體培養(yǎng)基靈敏度≥10^-8，或1組固體培養(yǎng)基有支原體菌落生長，取2倍待檢品重檢。重檢后，如液體培養(yǎng)基靈敏度均≥10^-8，固體培養(yǎng)基均有支原體菌落生長，判為合格。否則，判為不合格。

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