【名稱】

非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（間接法）使用操作說明書

【作用與用途】

用于檢測(cè)豬血清中的非洲豬瘟（ASF）病毒抗體，評(píng)估養(yǎng)豬場(chǎng)ASF病毒疫苗免疫狀況及感染豬的血清學(xué)輔助診斷。

【檢測(cè)原理】

非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒采用間接ELISA法，在酶標(biāo)板條微孔上預(yù)包被基因重組的ASF病毒抗原。在實(shí)驗(yàn)中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有ASF病毒特異性抗體，則與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合；經(jīng)洗滌后除去未結(jié)合的抗體和其他成分后，再加入酶結(jié)合物，與酶標(biāo)板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔板中加入底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)孔中的吸光度OD值。

【主要成分與含量】

【需自備的材料】 去離子水、微量移液器、酶標(biāo)儀（450 nm）、計(jì)時(shí)器、37 ℃ 溫箱、離心機(jī)（4000 rpm）等。

【用法與判定】

1、用法

1.1 試劑配制

洗滌工作液：使用前，濃縮的洗滌液應(yīng)恢復(fù)至室溫（20～25℃），并搖動(dòng)，使沉淀溶解（最好在37℃恒溫培養(yǎng)箱中加熱5～10 min），然后用蒸餾水作10倍稀釋（例如：75 mL的濃縮洗滌液加上675 mL蒸餾水）混勻，稀釋好的洗滌液2～8℃可存放7日。

1.2 樣本處理

① 取動(dòng)物全血，待血液凝固后，4000 rpm離心10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，無溶血。

② 在血清稀釋板中按1:50稀釋待檢血清樣品（245 µL樣本稀釋液中加5 µL待檢血清樣品），充分混勻。

注：陰、陽性對(duì)照不用稀釋。

1.3 操作步驟

① 取酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100 µL加至酶標(biāo)板中。同時(shí)設(shè)陰、陽性對(duì)照各2孔，取陰性、陽性對(duì)照各100 µL分別加入反應(yīng)孔中。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應(yīng)30 min。

② 棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液300 µL，靜置1 min后，棄去洗滌液。洗滌4次后在吸水紙上拍干。

③ 配制酶結(jié)合物工作液:按體積比1:100（1份酶結(jié)合物濃縮液+99份酶結(jié)合物稀釋液）混勻備用。

④ 每孔加酶結(jié)合物工作液100 µL，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應(yīng)30 min。

⑤ 棄去孔中的溶液，洗滌4次，方法同②。

⑥ 將底物A液與底物B液按1:1混合，加入孔中，100 µL/孔，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應(yīng)15 min。

⑦ 每孔加入終止液50 µL，5 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。

2、判定

在酶標(biāo)儀上讀各孔OD450nm值。

① 試驗(yàn)成立的條件：

陰性對(duì)照平均OD450nm值＜0.20且陽性對(duì)照平均OD450nm值≥1.0，試驗(yàn)結(jié)果才有效；否則，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

② 計(jì)算方法：

③ 陰陽性判斷：

S/P＜0.2時(shí)，判為陰性；S/P≥0.2時(shí)，判為陽性。

【注意事項(xiàng)】

1、試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫。使用后放回2~8℃保存。

2、不同批號(hào)的試劑盒組份不得混用，不同試劑使用時(shí)應(yīng)防止交叉污染。

3、底物液和終止液不能暴露于強(qiáng)光或接觸氧化劑。

4、待檢血清數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)先稀釋完所有待檢血清，再加到抗原包被板上，使反應(yīng)時(shí)間一致。

5、稀釋10×濃縮洗滌液時(shí)，如發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，應(yīng)加熱使其溶解后再使用。

6、移液時(shí)，應(yīng)盡量準(zhǔn)確，防止產(chǎn)生氣泡。

7、應(yīng)嚴(yán)格遵守各操作步驟規(guī)定的時(shí)間和溫度。

【貯藏與有效期】2～8℃避光保存，有效期為12個(gè)月。

【規(guī)格】96孔/盒；192孔/盒

【生產(chǎn)企業(yè)】

北京中海生物科技有限公司

中海生物技術(shù)（棗莊）有限公司

網(wǎng)址：hndhjn.com

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